2021年3月
62卷,第3期
开放访问
解剖和病理学/肿瘤学 |2021年3月
Aurora激酶B表达,其调节和治疗靶向人视网膜母细胞瘤
作者隶属关系和票据
  • Naheed Arfin Borah.
    印度布巴内斯瓦尔LV普拉萨德眼科研究所眼癌手术眼科研究所
    生物技术学院,基特大学,印度Bhubaneswar
  • Swatishree sradhanjali.
    印度布巴内斯瓦尔LV普拉萨德眼科研究所眼癌手术眼科研究所
    生物技术学院,基特大学,印度Bhubaneswar
  • Manas Ranjan Barik.
    印度布巴内斯瓦尔LV普拉萨德眼科研究所眼癌手术眼科研究所
  • Atimukta Jha.
    印度布巴内斯瓦尔生命科学研究所免疫基因组学和系统生物学实验室
    宣布高等教育学院,印度
  • devjyoti tripathy
    眼科塑料,轨道和眼部肿瘤服务,LV Prasad Eye Institute,Bhubaneswar,印度
  • Swathi Kaliki.
    手术视力普遍研究所眼癌,LV Prasad Eye Institute,印度海德拉巴
  • Suryasnata Rath.
    眼科塑料,轨道和眼部肿瘤服务,LV Prasad Eye Institute,Bhubaneswar,印度
  • 苏尼尔•k•拉
    印度布巴内斯瓦尔生命科学研究所免疫基因组学和系统生物学实验室
  • Srinivas Patnaik.
    生物技术学院,基特大学,印度Bhubaneswar
  • 前腿米塔尔
    Kanupriya Dalmia眼科病理实验室,LV Prasad Eye Institute,印度Bhubaneswar
    印度布巴内斯瓦尔卡林加医学科学研究所病理科
  • Mamatha M. Reddy.
    印度布巴内斯瓦尔LV普拉萨德眼科研究所眼癌手术眼科研究所
    生物技术学院,基特大学,印度Bhubaneswar
  • 通信:Mamatha M. Reddy,操作视力全身眼科癌症研究所,LV Prasad Eye Institute,Patia,Bhubaneswar 751024;mamathamuppidi@gmail.com;mamatha@lvpei.org.
  • 脚注
    # DT,SK和SR同样地贡献到这里提供的工作,因此应该被视为同等作者。
调查眼科与视觉科学 2021年3月,第62、16期。doi:https://doi.org/10.1167/iovs.62.3.16
抽象的

目的:Aurora激酶B(Aurkb)在调节有丝分裂的调节中起着枢轴作用,并且在癌症中获得突出症状;然而,尚未研究AurkB在视网膜母细胞瘤(RB)中的作用。本研究的目的是确定AURKB是否在RB中发挥作用,如何调节其表达式,以及是否可以专门针对性。

方法:采用免疫组化方法检测人RB患者标本和免疫印迹细胞系中AURKB的蛋白表达。通过药理抑制和shrna介导的敲除来了解AURKB在细胞活力、凋亡和细胞周期分布中的作用。在去核RB标本中也评估了AURKB抑制对细胞活力的影响。免疫印迹法测定磷酸组蛋白H3、p53、p21和MYCN的蛋白水平。染色质免疫沉淀- qpcr验证MYCN结合在启动子区Aurkb.

结果:aukb在人RB组织中表达明显升高,且过表达与视神经及前房侵犯程度显著相关。伟德2021欧洲杯外围用小分子抑制剂和shrna靶向AURKB导致细胞存活减少,凋亡增加,细胞周期阻滞在G2/M期。更重要的是,原发RB标本显示受药物AURKB抑制的影响,细胞活力下降。其他研究表明MYCN致癌基因调控RB中AURKB的表达。

结论:AURKB在RB中过表达,靶向治疗可以作为一种新的抑制肿瘤细胞生长的治疗策略。

视网膜母细胞瘤(RB)是一种恶性的儿童眼内肿瘤,占所有儿童癌症的4%。1虽然发达国家的治疗成果有所改善,但RB仍然是低收入和中等收入国家的主要问题,从中报告了超过80%的案件。2对于相当数量的RB患儿(35%),剜核术仍然是首选的治疗选择。3.非洲国家常见的外塞差和死亡,4亚洲RB患者中常见视神经、脉络膜浸润等组织学危险因素。5治疗RB常用长春新碱、依托泊苷、卡铂、美法伦、拓替康等药物化疗;然而,并不是所有的儿童都对治疗有反应,那些有反应的儿童可能会遭受长期的副作用。6 , 7此外,有些孩子患上急性髓性白血病和骨肉瘤等次要恶性肿瘤。8 , 9
RB启动和进展需要双射击灭活RB1基因和随后的事件,如涉及途径的改变Mycn.,E2F3,de,MDM410.最近,一个不同的RB子集没有明显RB1已发现突变会导致基因扩增Mycn.oncogene。11.RB1在细胞周期进程的调控中起着重要作用。其他的有丝分裂调控因子,如polo样激酶1 (PLK1)已经被证明在不同的肿瘤中过表达12.与组织学危险因素相关,如脉络膜侵袭和RB的差异差。13.抑制PLK1进一步提高了热疗敏感性,已知这对RB的局灶治疗很重要。14.最近,涉及细胞周期调节的几种关键蛋白质如极光激酶在癌症中的合理治疗靶标的显着性。15. , 16.
极光激酶是控制有丝分裂(极光激酶A和B)和减数分裂(极光激酶C)的丝氨酸/苏氨酸激酶。16. , 17.极光激酶B (Aurora kinase B, AURKB)是染色体客染色体复合体的一部分,它有助于染色体的凝聚和分离,促进胞质分裂。18.Aurkb的过度表达导致非洲倍性,导致基因组不稳定性并增加肿瘤发育的可能性(参考16.)。此外,靶向极光激酶已经被证明在临床前肿瘤模型中是有益的(在文献中回顾15.17.)。目前,AURKB在RB中的作用尚未确定。在本研究中,我们验证了AURKB过表达与RB发病机制有关的假说。首先,用免疫学方法评价了RB中AURKB的异常表达。然后选择3种AURKB抑制剂(GSK1070916、ZM447439和barasertib),评估它们对RB细胞存活、凋亡和细胞周期分布的影响。最后,我们研究了MYCN致癌基因对AURKB表达的调控。MYCN癌基因的扩增和/或表达被认为在视网膜母细胞瘤的发病机制中是重要的RB1失活。19. , 20.
材料和方法
伦理批准
本研究由LV Prasad Eye Institute,印度Bhubaneswar,印度的制度伦理委员会批准,并遵守赫尔辛基宣言的原则。
细胞培养
可商购的人RB细胞系Y79和WERI-RB1是从美国型文化收集(Manassas,VA,USA)采购的,并在RPMI-1640(Pan-Biotech,德国)辅以10%胎牛血清(FBS; Thermo Fisher Scientific,Waltham,Ma,USA)和1%(v / v)抗生素(青霉素 - 链霉素 - 两性霉素B混合物;潘生物技术)。前面描述的患者衍生的细胞(LRB1和LRB2)21.和从加入眼睛中分离的Rb原发性肿瘤细胞以与Rb细胞系类似的方式保持。人类视网膜色素上皮细胞系ARPE-19(美国型培养物收集)在Dulbecco的改性鹰介质中生长:营养混合物F-12(DMEM / F-12; PAN-BIOTECH)含有10%FBS。人胚胎肾(HEK)293T(美国型培养物收集),MCF-7和HCT-116细胞在补充有10%FBS的DMEM(Pan-Biotech)中培养。MCF-7和HCT-116细胞是Srinivas Patnaik博士的实验室,Kiit Biotechnology,Bhubaneswar博士的礼物。细胞系在冷冻小瓶的复发后3个月内使用,以及存在支原体如前所述进行了测试。22.
免疫印迹
免疫印迹法如前所述进行。23.该研究中使用的主要抗体是兔抗Aurkb单克隆抗体(1:40000稀释; Abcam,Cambridge,Ma,USA),小鼠抗P53单克隆抗体(1:500稀释; Santa Cruz Biotechnology,Dallas,TX,USA),小鼠抗β-肌动蛋白单克隆抗体(1:5000稀释; Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo,USA),兔抗磷酸组蛋白-H3(Ser10)单克隆抗体(1:1000稀释;细胞信号传导技术,贝弗利,马,美国),兔抗P21 WAF1 / CIP1(P21)单克隆抗体(1:1000稀释;细胞信号传导技术),兔抗组蛋白H3多克隆抗体(1:1000稀释;细胞信号传导技术),兔抗Mycn单克隆抗体(1:1000稀释;细胞信号技术)。
Aurkb的mRNA表达分析
使用TrizoL试剂(Thermo Fisher Scientific)从不同的细胞系中分离出总RNA。使用cDNA合成试剂盒(Bio-rad Laboratories,Hercules,Ca,USA)并在特定引物-Aurkb f,Tcctcttcaagtcccagataga的存在下进行等量的RNA逆转录的RNA逆转录。Aurkb r,tagatcctcctcgggtcataaa;和Sybr Green Master Mix(Bio-Rad Laboratories)。β2微球蛋白(B2M)用作对照(B2M F,TATCCAGCGTACTCCAAAGA; B2M R,GacaAGTCTGAATGCTCCAC)。
免疫组织化学
评估总共51个enucleated的RB组织标本用于检测AurkB蛋白表达。福尔马林固定的,将石蜡包埋的组织切片置于涂有(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(Sigma-Aldrich)的玻璃载玻片上,使用Envision Flex Mini Kit(Agilent,Santa Clara,CA,USA,美国)根据制造商的协议。兔抗Aurkb单克隆抗体在1:250稀释中使用。使用aperio CS2滑动扫描显微镜(Leica Microsystems,Wetzlar,德国)捕获图像。此外,在Olympus BX53显微镜(Olympus,日本Olympus,日本)上以100×目的拍摄图像以进行评分和数据分析。
IHC幻灯片的评分
根据表达的强度和程度对组织标本中的AURKB表达进行免疫反应性评分。这种计分方法已经在前面描述过了。24.表达的强度()采用以下评分进行量化:0 =负,1 =弱,2 =中,3 =高。表达的程度被评为积极染色面积的比例相比,整个肿瘤区域,和下面的分数分配:0为< 1%、1 2%至10%,2 11%提高到50%,3为> 51%到75%和4 75%区域显示表达式。最终免疫组化评分如下:Σ = 0到3(×基于表达范围的分数)。上述表达的结果将显示最小IHC得分为0至最多12. IHC评分为10到12的IHC得分被认为是强烈的表达;7至9,中等表达;和3到6,表达弱。<3的IHC得分是没有表达的。
shrna介导的敲低
AurkB的敲低使用慢病毒方法在Y79和LRB1细胞中进行。该研究中使用的ShRNA构建体是KD-1(TRCN0000000777)和KD-2(TRCN0000010547)(Dharmacon,Lafayette,Co,USA)。另外,ShRNA构建KD-3(TRCN0000020695)和KD-4(TRCN0000020698)(Dharmacon)用于Mycn敲低。通过使用Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)转染HEK293T细胞来产生含有靶向AURKB或加扰对照的构建体的慢病毒。病毒上清液用于在含有聚苯(4μg/ ml; sigma-Aldrich)存在下转换Y79或LRB1细胞。在含含嘌呤霉素(3μg/ mL,Sigma-Aldrich)的培养基中选择转导细胞,通过免疫印迹确认敲低效率。
AURKB的药理抑制和细胞活力的测定
通过使用市售的AURKB抑制剂barasertib (azd1162 - hqpa)、GSK1070916和ZM447439 (Apex Bio, Houston, TX, USA),可以抑制RB细胞中的AURKB。使用台盼蓝染料(Sigma-Aldrich)排除法检测细胞活力。与未经处理或混乱的对照组相比,抑制剂处理或shrna介导的敲除引起的细胞活力下降。
细胞凋亡检测
根据制造商的说明(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany),使用BD FACSCanto II流式细胞仪(BD Biosciences, San Jose, CA, USA),使用annexin V和碘化丙啶(PI)染色,分析了抑制剂处理和aurkb下调RB细胞的凋亡百分率。
细胞周期分析
使用PI染色检查了在AurkB抑制时细胞周期分布的变化。简而言之,用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水(DPBS; Pan-Biotech)洗涤100万细胞,并固定在70%冷乙醇中。在固定1小时后和所需的洗涤后,用50μL的RNA酶(QIAGEN,Hilden,德国)处理样品,从100μg/ mL股票处理,并在37℃下孵育30分钟。最后,在使用Cytoflex的流量表(Beckman Coulter,Brea,USA)分析之前,将200μlPI加入样品中。
AURKB基因启动子的硅质分析
启动子序列Aurkb.使用Ensembl(版本100)检索基因(2kb上游转录开始站点)25.并分析了之前报道的MYCN绑定基序的存在。26. - - - - - - 28.
染色质免疫沉淀 - QPCR
采用染色质免疫沉淀(ChIP) -qPCR研究MYCN是否结合于Aurkb.。简而言之,Y79细胞(40×106)与甲醛交联并用甘氨酸中和。用冷PBS洗涤电池沉淀,并在冰上重新悬浮在核萃取缓冲液(5mM管,pH8.0; 85mm KCl;和0.5%NP-40)上。将核颗粒重悬于放射免疫沉淀法测定缓冲液中并在4℃下超声处理15分钟,以产生100至600bp的染色质片段。用芯片级Mycn抗体(1:50稀释;细胞信号传导技术)免疫乳蛋白(150μg)。使用NaCl反转洗脱蛋白/ DNA复合物的交联,并用蛋白酶K和RNase处理,然后使用PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化。芯片QPCR引物列于补充表S1。浓缩的百分比是相对于阴性对照引物来扩增区域远离Aurkb.启动子序列。
统计分析
使用描述性统计评估基线和疾病特征。使用Ⅳ确定Aurkb和临床病理学关联的表达2测试和学生的T.以及。药理学、shrna敲除和ChIP-qPCR实验由学生进行分析T.以及。
结果
AURKB在人RB肿瘤标本和细胞系中显著过表达
通过免疫印迹测定AurkB的蛋白质表达,并发现与对照视网膜相比,在人RB细胞系中被发现升高(图。1一种)。表达水平在不同的RB细胞系中是相当的。我们在进一步的实验中使用了商业上可获得的Y79细胞系和患者衍生的LRB1细胞。为了将AurkB与其他肿瘤细胞系的表达进行比较,我们测量MCF-7(乳腺癌)和HCT-116(结肠癌)细胞中的mRNA表达。另外,在ARPE-19细胞中测定AurkB的表达。在所有测试的细胞系中,RB细胞具有相当高的Aurkb表达(补充图。S1)。
图1。
AURKB在RB中过表达。(一个)免疫印迹法测定RB细胞与对照视网膜(CR)中AURKB蛋白的表达。(b)人类RB患者标本中AURKB表达的IHC评分(n = 48)。(c)保留视网膜的代表性图像显示无AURKB表达,肿瘤标本显示弱表达、中等表达或强表达(上面板)。的底部面板显示出显示弱(n = 11),中等(n = 16),或强(n = 9)aurkb表达的肿瘤试样中染色细胞的分布。
图1。
AURKB在RB中过表达。(一个)免疫印迹法测定RB细胞与对照视网膜(CR)中AURKB蛋白的表达。(b)人类RB患者标本中AURKB表达的IHC评分(n = 48)。(c)保留视网膜的代表性图像显示无AURKB表达,肿瘤标本显示弱表达、中等表达或强表达(上面板)。的底部面板显示出显示弱(n = 11),中等(n = 16),或强(n = 9)aurkb表达的肿瘤试样中染色细胞的分布。
接下来,我们通过免疫组化方法评估了人类RB组织标本(n = 51)中AURKB的表达。51例标本中,有3例因广泛坏死和钙化而被排除在研究之外,只有局灶性存活。其余48例标本中,16例为接受新辅助化疗的患者。患者的基线特征在桌子。免疫组织化学染色显示36个样品(75%)的阳性AurkB染色,其中有21个男性和15名女性。基于正染色的强度和程度,IHC载玻片得分。在11(30.56%),16(44.44%)和9(25%)标本中,观察到36种样品,弱,中等和强烈的表达,分别观察到(图。1b)。染色组织标本(顶部面板)的代表性图像及其各自的染色细胞分布(底部面板)图1C。此外,将肿瘤区域中的AurkB表达与相邻的保守健康视网膜进行比较,并且观察到在保守视网膜中表达水平可忽略不计(图。1C)。此外,临床病理学特征与AURKB表达的存在相关(桌子)。统计学分析显示视神经侵袭和阳性AurkB表达之间的显着相关性(P< 0.05)。此外,Aurkb的表达与前房侵袭有关(P< 0.05)。其他临床病理特征(桌子)。
表格
RB患者标本中AURKB阳性表达与临床病理特征的相关性
表格
RB患者标本中AURKB阳性表达与临床病理特征的相关性
RB患者标本中AURKB阳性表达与临床病理特征的相关性
药物抑制AURKB导致RB细胞活力下降
在RB细胞中研究了作为潜在治疗策略的AurkB抑制(Y79,LRB1和LRB2)。该研究中使用的抑制剂是GSK1070916,Barasertib和ZM447439。72小时后评估细胞活力。可以看出,Aurkb抑制在Y79和LRB1细胞中降低细胞活力(图2a)和在lrb2细胞中(补充图。S2)。例如,在GSK1070916浓度为20 nm时,Y79细胞的活力相对于对照组下降了60.77%±3.44%。相比之下,LRB1细胞对GSK1070916更敏感,在7 nm处细胞活力下降65.40%±1.44%。的集成电路50计算每个细胞系的所有抑制剂值(补充表S2)。总的来说,通过增加AurkB抑制剂的浓度增加来检测细胞活力的一致减少。通过测量磷酸组蛋白H3(SER10)水平来评价AurkB抑制的特异性,与对照细胞相比,在抑制剂处理的细胞中观察到深度减少(图2b)。对GSK1070916进行响应于GSK1070916的细胞活力的变化在原发性人RB患者标本上进一步测试,并观察到在处理过的细胞中显着降低(图2C)。使用GSK1070916的AurkB抑制的影响也在对照人视网膜颜料上皮细胞系(ARPE-19)上进行测试,并且发现对人RB患者标本有效的浓度可忽略不计,证明了用于靶向AURKB的治疗窗口在rb(补充图S3)。
图2。
在RB细胞中,药物抑制AURKB可降低细胞活力。(一个)用Aurkb抑制剂治疗72小时后Rb细胞的细胞活力。误差栏代表标准偏差(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P学生<0.001T.以及)。(b)在AURKB抑制的RB细胞中显示组蛋白H3(SER 10)的磷酸化的免疫印迹。(c)用GSK1070916治疗72小时后患者衍生的原发性肿瘤细胞的细胞活力。
图2。
在RB细胞中,药物抑制AURKB可降低细胞活力。(一个)用Aurkb抑制剂治疗72小时后Rb细胞的细胞活力。误差栏代表标准偏差(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P学生<0.001T.以及)。(b)在AURKB抑制的RB细胞中显示组蛋白H3(SER 10)的磷酸化的免疫印迹。(c)用GSK1070916治疗72小时后患者衍生的原发性肿瘤细胞的细胞活力。
RB中靶向AURKB可促进G2/M期细胞凋亡和积累
通过使用流式细胞仪分析AurkB抑制对凋亡程度的程度。该研究中使用的抑制剂浓度是IC50和10次IC50如前所述(补充表S2)。我们注意到,与对照相比,在抑制剂处理的Y79细胞中,细胞凋亡增加(图3.a)和LRB1细胞(补充图S4a)以剂量依赖的方式。另外,通过采用在凋亡实验中使用的相同浓度的抑制剂,在抑制剂处理的RB细胞中评价p53和P21 WAF1 / CIP121(P21)蛋白的水平。观察到P53和P21的蛋白质表达在Y79细胞中增加(图3.b)和LRB1细胞(补充图S4b).接下来,我们评估了AURKB在RB细胞周期进程中的作用。经AURKB抑制剂处理的细胞用PI染色,流式细胞仪分析。实验所用药物浓度为IC50,2×IC50、10× IC50(补充表S2)。结果表明,在Y79细胞周期中,AURKB抑制导致G2/M期阻滞(图3.c)和LRB1细胞(补充图S4C)。
图3。
在细胞周期的G2/M期,抑制AURKB可增加细胞凋亡并诱导细胞积累。(一个)用不同AurkB抑制剂治疗时,Y79细胞的总细胞凋亡。(b)P53和P21蛋白表达水平在抑制剂处理的Y79细胞中。(c) aukb抑制剂处理后的Y79细胞周期分布。将GSK1070916处理后的细胞与未处理1(*)的细胞进行比较,其余的细胞与未处理2(#)的细胞进行比较。误差条表示均值的标准误差(* /# P< 0.05,** / ## P学生的<0.01T.以及)。
图3。
在细胞周期的G2/M期,抑制AURKB可增加细胞凋亡并诱导细胞积累。(一个)用不同AurkB抑制剂治疗时,Y79细胞的总细胞凋亡。(b)P53和P21蛋白表达水平在抑制剂处理的Y79细胞中。(c) aukb抑制剂处理后的Y79细胞周期分布。将GSK1070916处理后的细胞与未处理1(*)的细胞进行比较,其余的细胞与未处理2(#)的细胞进行比较。误差条表示均值的标准误差(* /# P< 0.05,** / ## P学生的<0.01T.以及)。
ShRNA介导的AurkB敲低导致细胞活力下降
为了证实AURKB在RB中的作用,我们在Y79和LRB1细胞中进行了shrna介导的慢病毒敲除。用经过修饰的shRNA转导的细胞作为对照。免疫印迹证实了aurkb敲低的有效性,并且发现在aurkb敲低的细胞中p53水平升高(图4.A,顶部面板)。接下来,每天在敲低和加扰控制细胞中评估细胞活力的变化5天。与Y79和LRB1细胞中的加扰对照相比,在敲低细胞中观察到细胞活力的显着降低(图4.一个,底部面板)。结果对于研究中使用的ShRNA构建体一致。此外,与用炒ShRNA构建体转导的细胞相比,具有α敲低的细胞中凋亡百分比具有更高的细胞凋亡百分比(图4.b)。在Y79细胞中,分别用KD-1和KD-2构建体检测26.6%±6.4%和25.76%±7.05%的细胞凋亡,相当于加扰控制细胞中的10.46%±2.31%凋亡(图4.b)。类似于抑制实验,在用ShRNA构建KD-1转导的Y79细胞中注意到G2 / M期细胞周期停滞(图4.C)。
图4。
RB的Aurkb-knowsdown导致抑制细胞生长,升高的凋亡和G2 / M相的细胞积累。(一个)使用Aurkb-kextown的RB细胞中的Aurkb敲低和P53水平(上面板)。与打乱的对照组细胞相比,敲除细胞的细胞活力(底部面板)。分析了与Aurkb敲低的Y79细胞(b)细胞凋亡总数及(c)细胞周期分布。误差栏表示SD(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P< 0.001由学生的T.以及)。
图4。
RB的Aurkb-knowsdown导致抑制细胞生长,升高的凋亡和G2 / M相的细胞积累。(一个)使用Aurkb-kextown的RB细胞中的Aurkb敲低和P53水平(上面板)。与打乱的对照组细胞相比,敲除细胞的细胞活力(底部面板)。分析了与Aurkb敲低的Y79细胞(b)细胞凋亡总数及(c)细胞周期分布。误差栏表示SD(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P< 0.001由学生的T.以及)。
Mycn oncogene的Aurkb表达调节
Mycn oncogene被认为是在视网膜母细胞瘤的发展和进展中很重要RB1失活。尚可讨论MYCN在各种蛋白质的转录调节中发挥作用。10. , 19. , 20.为了研究MYCN在AURKB表达调控中的作用,我们首先分析了MYCN的启动子序列Aurkb.MYCN绑定主题的存在。的Aurkb.使用Ensembl(版本100)下载启动子序列25.并扫描基于先前公布的研究的Mycn绑定图案存在26.和真核启动子数据库。27. , 28.分析发现转录起始位点上游有5个MYCN结合基序(图5.a),提示MYCN可能在aukb表达调控中发挥作用。
图5。
在RB细胞中,aukb的表达受MYCN的调控。(一个)Mycn绑定主题的存在Aurkb.基因启动子。基因组序列NC_000017.11和序列8210574 ~ 8212573。+1表示转录起始位点。(b)具有Mycn-kersickdown的RB细胞中的Aurkb蛋白质水平,和(c) RB细胞中MYCN蛋白水平与aurkb敲除有关。(d)芯片QPCR显示富含Mycn绑定主题的富集Aurkb.启动子。
图5。
在RB细胞中,aukb的表达受MYCN的调控。(一个)Mycn绑定主题的存在Aurkb.基因启动子。基因组序列NC_000017.11和序列8210574 ~ 8212573。+1表示转录起始位点。(b)具有Mycn-kersickdown的RB细胞中的Aurkb蛋白质水平,和(c) RB细胞中MYCN蛋白水平与aurkb敲除有关。(d)芯片QPCR显示富含Mycn绑定主题的富集Aurkb.启动子。
为了破译Mycn和Aurkb之间的可能串扰,我们研究了使用Mycn敲低的RB细胞中Aurkb的表达,以及M​​ycn在Aurkb敲低细胞中的表达。与MyCN敲低细胞中的加扰对照相比,我们检测到Y79和LRB1细胞中的AurkB蛋白水平减少(图5.b)。然而,我们没有观察到具有Aurkb-kersextdown的RB细胞中Mycn蛋白表达的任何显着变化(图5.C)。
为了进一步了解MYCN是否与启动子区结合Aurkb.,我们在Y79细胞中使用ChIP级MYCN抗体进行ChIP实验,然后使用特定引物进行qPCR,扩增包含MYCN结合基序的区域。结果表明,与阴性对照相比,启动子区-1064处的MYCN结合基序(图5.d)。
讨论
我们的研究表明,AurkB在人RB患者标本中显着过表达,进一步揭示了相邻肿瘤的形态健康的保守视网膜是缺乏AurkB表达的。由于它挑战了瞄准功能丧失突变,例如RB1灭活,鉴定与肿瘤发生有关的药物蛋白可以提供替代的治疗靶点。与保留视网膜相比,人类RB标本中存在较高的AURKB水平,这表明抑制AURKB可能是一种潜在的治疗策略。AURKB的过表达与多种恶性肿瘤有关(综述见文献15.)。例如,在非小细胞肺癌中,发现AurkB与上皮细胞相比,升高。29. , 30.同样,在各种其他癌症中已经建立了诱导的AurkB蛋白表达,包括急性淋巴细胞白血病和急性髓性白血病。31Aurkb在肿瘤中的作用最初通过其鼠模型中过表达介导的肿瘤引发来支持。32在分子水平上,AURKB调节p21的抑制Cip1通过p5333与组蛋白去乙酰化酶一起,通过AKT/mTOR信号通路介导细胞增殖。34此外,AURKB表达的改变与癌细胞的基因组不稳定性有关。29.
视神经、脉络膜、巩膜和前房的侵犯是RB疾病预后的重要组织学危险因素。35在本研究中,我们确定了AURKB的过表达与视神经和前房侵犯相关。AURKB与视神经及前房受累的关系提示它可能与RB的侵袭转移有关。同样,在非小细胞肺癌中,AURKB过表达与肿瘤侵袭、淋巴结转移和不良预后有关。36
本研究通过下调和药理抑制实验证实了AURKB上调对RB细胞存活的意义。这是特别相关的,因为AURKB抑制剂处于不同的临床开发阶段15. , 17. , 37可以翻译为人类应用。因为目前还没有合适的动物模型可以复制人类RB,所以在原发RB组织中测试药物靶点的抑制是至关重要的。伟德2021欧洲杯外围38因为rb中的组织尺寸非常小,所以我们只能使用其中一种抑制剂。我们使用抑制剂GSK1070916抑制RB患者标本中的AurkB,与其他抑制剂相比,它在较低浓度下有效。在RB患者标本中,抑制AurkB的抑制性可见性显着降低,但在相同浓度下对正常视网膜颜料上皮细胞没有影响。此外,具有最高AurkB表达的患者样品比其他标本比另一个标本相对较好地响应响应较好;但是,对Aurkb抑制的反应是否取决于表达水平需要进一步调查。总的来说,我们的数据表明我们可以专门针对AURKB来限制RB细胞增长。该研究表明,抑制AurkB抑制的含量较为受损,抑制凋亡和升高水平的P53和G2 / M期细胞周期停滞。Aurkb在逐步降低P53活动中的作用已经研究过。39 , 40最近的研究涉及小细胞肺癌RB1突变表现出对Aurkb的生存依赖性深刻依赖。在这些中的Aurkb抑制RB1突变肿瘤显著影响其细胞生长,可能通过一种合成致死关系RB1突变和aurkb抑制。41此外,Aurkb涉及与B细胞急性淋巴细胞白血病的治疗相关的耐药性和治疗复发。42进一步提出AurkB抑制作为耐药肿瘤细胞的干预策略,特别是对表皮生长因子受体中具有耐药性突变的非小细胞肺癌细胞。43
调节AurkB表达的分子激活剂不完全理解。我们已确定用于Mycn的共识绑定图案Aurkb.这表明MYCN可能调控AURKB的表达。MYCN的扩增和/或表达已经被认为是RB发病后的重要事件RB1突变。19. , 20. , 44基于这些观察,我们设计了一项研究,以调查Mycn-kerkswows对Aurkb表达的影响。响应RB细胞中的Mycn敲低响应AurkB的表达而持续减少。此外,CHIP-QPCR显示MyCN对启动子区域结合Aurkb.,结合的程度与其他已知的基因启动子序列的结合相当。45 , 46MYCN对AURKB表达的调节特别有趣,因为它与RB发病机制有关。一些其他的途径也被发现在肿瘤细胞中调节AURKB的表达。例如,MDM2通过AURKB的表达介导前列腺癌细胞的细胞周期。47同样,在神经母细胞瘤中,Aurkb被鉴定为Mycn的直接转录靶标Mycn.- 化的神经母细胞瘤。48MYCN的AURKB监管将进一步提示Aurkb治疗靶向的可能性Mycn.-扩增RB肿瘤除视网膜母细胞瘤与RB1突变。
总体而言,我们的研究表明,AURKB的表达在RB中升高,阳性AURKB表达与视神经和前房侵袭显着相关。更重要的是,我们的研究表明,Aurkb可以专门针对RB。此外,我们的结果表明MYCN的Aurkb表达可能调节。
致谢
作者感谢Bikash Ranjan Sahu博士(印度布巴内斯瓦尔基it大学生物技术学院)和Kalandi Charan Muduli博士(印度布巴内斯瓦尔LV Prasad眼科研究所)在流式细胞术和免疫组化方面的帮助。
印度科技部生物技术学系创新青年生物技术学者奖(to M.M.R.) (BT/09/IYBA/2015/10)和卓越研究中心续期资助(BT/PR32404/MED/30/2136/2019);印度生物技术部)。另外还得到了海德拉巴眼科研究基金会、LV Prasad眼科研究所的支持。
披露:N.A. Borah,没有任何;S. Sradhanjali.,没有;核磁共振Barik,没有;答:杰哈,没有;d . Tripathy,没有;美国Kaliki,没有;S. RATH.,没有;”栏目Raghav,没有;S. Patnaik.,没有;r·米塔尔,没有;M.M. Reddy, 没有任何
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图1。
AURKB在RB中过表达。(一个)免疫印迹法测定RB细胞与对照视网膜(CR)中AURKB蛋白的表达。(b)人类RB患者标本中AURKB表达的IHC评分(n = 48)。(c)保留视网膜的代表性图像显示无AURKB表达,肿瘤标本显示弱表达、中等表达或强表达(上面板)。的底部面板显示出显示弱(n = 11),中等(n = 16),或强(n = 9)aurkb表达的肿瘤试样中染色细胞的分布。
图1。
AURKB在RB中过表达。(一个)免疫印迹法测定RB细胞与对照视网膜(CR)中AURKB蛋白的表达。(b)人类RB患者标本中AURKB表达的IHC评分(n = 48)。(c)保留视网膜的代表性图像显示无AURKB表达,肿瘤标本显示弱表达、中等表达或强表达(上面板)。的底部面板显示出显示弱(n = 11),中等(n = 16),或强(n = 9)aurkb表达的肿瘤试样中染色细胞的分布。
图2。
在RB细胞中,药物抑制AURKB可降低细胞活力。(一个)用Aurkb抑制剂治疗72小时后Rb细胞的细胞活力。误差栏代表标准偏差(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P学生<0.001T.以及)。(b)在AURKB抑制的RB细胞中显示组蛋白H3(SER 10)的磷酸化的免疫印迹。(c)用GSK1070916治疗72小时后患者衍生的原发性肿瘤细胞的细胞活力。
图2。
在RB细胞中,药物抑制AURKB可降低细胞活力。(一个)用Aurkb抑制剂治疗72小时后Rb细胞的细胞活力。误差栏代表标准偏差(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P学生<0.001T.以及)。(b)在AURKB抑制的RB细胞中显示组蛋白H3(SER 10)的磷酸化的免疫印迹。(c)用GSK1070916治疗72小时后患者衍生的原发性肿瘤细胞的细胞活力。
图3。
在细胞周期的G2/M期,抑制AURKB可增加细胞凋亡并诱导细胞积累。(一个)用不同AurkB抑制剂治疗时,Y79细胞的总细胞凋亡。(b)P53和P21蛋白表达水平在抑制剂处理的Y79细胞中。(c) aukb抑制剂处理后的Y79细胞周期分布。将GSK1070916处理后的细胞与未处理1(*)的细胞进行比较,其余的细胞与未处理2(#)的细胞进行比较。误差条表示均值的标准误差(* /# P< 0.05,** / ## P学生的<0.01T.以及)。
图3。
在细胞周期的G2/M期,抑制AURKB可增加细胞凋亡并诱导细胞积累。(一个)用不同AurkB抑制剂治疗时,Y79细胞的总细胞凋亡。(b)P53和P21蛋白表达水平在抑制剂处理的Y79细胞中。(c) aukb抑制剂处理后的Y79细胞周期分布。将GSK1070916处理后的细胞与未处理1(*)的细胞进行比较,其余的细胞与未处理2(#)的细胞进行比较。误差条表示均值的标准误差(* /# P< 0.05,** / ## P学生的<0.01T.以及)。
图4。
RB的Aurkb-knowsdown导致抑制细胞生长,升高的凋亡和G2 / M相的细胞积累。(一个)使用Aurkb-kextown的RB细胞中的Aurkb敲低和P53水平(上面板)。与打乱的对照组细胞相比,敲除细胞的细胞活力(底部面板)。分析了与Aurkb敲低的Y79细胞(b)细胞凋亡总数及(c)细胞周期分布。误差栏表示SD(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P< 0.001由学生的T.以及)。
图4。
RB的Aurkb-knowsdown导致抑制细胞生长,升高的凋亡和G2 / M相的细胞积累。(一个)使用Aurkb-kextown的RB细胞中的Aurkb敲低和P53水平(上面板)。与打乱的对照组细胞相比,敲除细胞的细胞活力(底部面板)。分析了与Aurkb敲低的Y79细胞(b)细胞凋亡总数及(c)细胞周期分布。误差栏表示SD(* P< 0.05,* * P< 0.01,*** P< 0.001由学生的T.以及)。
图5。
在RB细胞中,aukb的表达受MYCN的调控。(一个)Mycn绑定主题的存在Aurkb.基因启动子。基因组序列NC_000017.11和序列8210574 ~ 8212573。+1表示转录起始位点。(b)具有Mycn-kersickdown的RB细胞中的Aurkb蛋白质水平,和(c) RB细胞中MYCN蛋白水平与aurkb敲除有关。(d)芯片QPCR显示富含Mycn绑定主题的富集Aurkb.启动子。
图5。
在RB细胞中,aukb的表达受MYCN的调控。(一个)Mycn绑定主题的存在Aurkb.基因启动子。基因组序列NC_000017.11和序列8210574 ~ 8212573。+1表示转录起始位点。(b)具有Mycn-kersickdown的RB细胞中的Aurkb蛋白质水平,和(c) RB细胞中MYCN蛋白水平与aurkb敲除有关。(d)芯片QPCR显示富含Mycn绑定主题的富集Aurkb.启动子。
表格
RB患者标本中AURKB阳性表达与临床病理特征的相关性
表格
RB患者标本中AURKB阳性表达与临床病理特征的相关性
RB患者标本中AURKB阳性表达与临床病理特征的相关性
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